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  • mRNA实时定量PCR

  • 简介
  • 实验流程
  •        实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差,提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化、比较不同组织的mRNA表达差异、验证基因新宝6下载和siRNA干扰的实验结果。

    Aksomics(康成生物)为您提供的一站式mRNA实时荧光定量PCR技术服务,您只需要提供保存完好的组织或细胞标本,本公司专业的技术服务人员就可替您完成mRNA实时定量PCR实验操作和数据分析,提供给您完整的实验报告,为您节省大量的时间和精力。全部实验皆使用进口试剂完成;定量PCR仪器为美国应用生物系统公司生产的荧光定量PCR仪ABI PRISM 7900、Corbett Research公司生产的离心式实时定量PCR仪Rotor-Gene 3000。

  • 1.设计并合成Realtime PCR引物

    2.引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG(SYBR® Green)的PCR反应的优化。

    3. RNA抽提

           a.若实验对象为组织样品,取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品,加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),匀浆后抽提RNA。
           b.若实验对象为细胞样品,每份样品取1×106~1×107细胞,完全吸去培养液后加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA。

    4. RNA质量检测
           a.紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,以计算其浓度并评估RNA纯度。
           b.使用甲醛电泳试剂(ambion)进行变性琼脂糖凝胶电泳,检测RNA纯度及完整性。

    5. cDNA合成
           按照逆转录酶(Invitrogen或Promega)5.使用说明将样品RNA逆转录为cDNA。

    6.制备标准曲线样品(可选)
           进行相对定量,需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增, 其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。

    7.实时定量PCR
           标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中(其中TaqBead热启动聚合酶来自Promega公司),进行RealTime PCR扩增和检测

    8.数据分析
           检测结果进行标准曲线分析,以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差,所得结果代表某样品的目的基因相对含量。

    9.提供实验报告:

            包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果及相关图表。