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  • Arraystar lncRNA新宝6下载检测的三个不可替代的要素

    lncRNA和mRNA分子结构相似,因此高通量筛选技术可以同时检测这两种类型的RNA。然而lncRNA也具有显著区别于mRNA分子的一些独特特征,这就导致lncRNA的表达谱筛选存在一定的困难,尤其是在分析平台的选择上。 Arraystar的 lncRNA微阵列新宝6下载是专门为克服这些挑战而设计,与NGS(新一代测序平台)相比具有不可替代的优势。

    要素1——可以精确检测lncRNA的差异表达

    GENCODE的统计结果分析表明,lncRNA的平均表达水平只有mRNA的1/10(下图左)[1]。甚至多数lncRNA在细胞中只有几个拷贝水平的表达,例如lncRNA ANRIL在细胞中只有1-2个拷贝,然而相比之下mRNA FOXF1有成百上千个拷贝(下图中)。另外,lncRNA的表达具有高度的组织特异性和时序特异性,以海马组织为例,不同的lncRNAs在不同的细胞类型和特定组织结构中才会表达(下图右)。尽管少数的lncRNA在特定的细胞中属于高丰度转录本,但是这种高丰度会被稀释在从整个组织块提取的总RNA中。这也是导致lncRNA丰度低的另一重要因素。

    图释:(左) lncRNA和mRNA的表达值统计结果展示图,(中) lncRNA ANRIL与mRNA FOXF1的FISH结果,(右)海马组织中lncRNA的高度组织特异性表达结果展示


    尽管细胞中lncRNA的丰度比较低,但是我们也不能忽略对它的研究。毕竟lncRNA和mRNA不一样,它是在transcript水平发挥功能;即使lncRNA有极低的拷贝数,同样可以发挥重要的调控作用。低丰度的lncRNA可以通过多种机制调控临近基因的表达,比如招募染色质重塑复合物来改变染色质的激活状态、招募剪切体来促进转录的起始或者作为eRNA来激活转录等等(图2)。与弥散型分布发挥trans(反式)功能的lncRNA相比,这种cis调控方式不需要lncRNA具有很高的表达水平就可以发挥效应,例如lncRNA-HOTTIP在细胞中只有1-2个拷贝,依然可以招募组蛋白修饰复合物WDR5/MLL发挥cis作用,从而调控临近的HOX基因簇;此外,eRNA(增强子类型的lncRNA)也是在低丰度时发挥的cis调控功能来激活临近基因的表达。


    图释:低拷贝的lncRNA通过锚定在转录位点附近来cis调控临近基因的表达


    准确定量lncRNA的丰度对于揭示lncRNA在较低水平下如何发挥调控功能是至关重要的。目前测序对于低丰度的lncRNA定量及差异分析存在一定的问题,如:

    (1)测序对lncRNA检测的错误率高。测序reads属于count数据,其错误率分布理论上遵循泊松模型,而实际测序过程中,错误率会更高,其分布遵循负二项超离散模型,随着RNA丰度的降低,测序的错误率迅速增加,要保证错误率小于20%,测序count需>100(下图)[3]。

    图释:测序错误率与RNA表达丰度关系


    (2)测序只能精确定量不足5%的lncRNA。测序存在高丰度RNA检测偏好,表达丰度最高的前1%的管家基因mRNA占据了测序数据的40%,低丰度的lncRNA的测序覆盖度很小,并且目前数据库收录和注释的lncRNA不全面,导致与数据库进行比对时很多lncRNA reads无法比对上而被忽略掉(下图左)。

    利用RNA sequins(已知序列和浓度梯度的一系列外源RNA)作为spike in control,以RNA sequins的观测值与实际值的线性相关程度作为参考评估内源RNA的表达准确性,并用LoQ(Limit of Quantification)作为阈值来反应能准确定量的最小RNA表达水平(下图右),结果发现当FPKM<3.13时,RNA观测值与实际值不呈线性关系并波动剧烈,不能被精确定量,mRNA中只有27.4%丰度满足精确定量要求,lncRNA则只有不到5% [4]。


    图释:(左)不同表达丰度RNA的测序覆盖度    (右)可被精确定量的lncRNA丰度及占比


    (3)测序能进行准确差异表达分析的lncRNA远小于4.7%。利用不同比例梯度的RNA sequins混合物作为spike in加入实验组和对照组,随后进行测序,评估内源RNA的差异表达显著性(下图左),结果表明差异倍数越大且表达丰度越高,差异结果越显著(P值越小)。利用LODR(Limit of Detection of Ratio)作为阈值评估差异结果显著(P<0.05, FC>2)需要的最小RNA表达水平,发现极少数lncRNA满足准确分析显著差异的表达丰度(下图右),数量远远低于测序能准确定量的lncRNA(约4.7%)[4]。


    图释 :可准确分析表达差异显著性的lncRNA丰度及差异倍数


    而微阵列新宝6下载是依靠固定在新宝6下载上的寡核苷酸探针去捕获并富集特异性靶序列,然后检测相应的荧光信号值。因此,与RNA-seq相比,微阵列的准确性受低丰度转录本的影响较小,2010年PANS发表的一篇文章同样也佐证了该观点[5]。

    下表比较了测序和新宝6下载对相同细胞进行lncRNA检测和差异分析的结果,由结果可以看出,新宝6下载较测序能检测更多的差异表达lncRNA:


    要素2——可以区分和检测lncRNA复杂且具有重要功能的转录异构体

    由于缺乏像mRNA那样具有开放阅读框的限制,lncRNA通常会被转录并剪切成各种转录异构体,并且这些异构体可能具有不同甚至相反的生物学功能。基因MEG3可以转录产生12个异构体,但是这12个异构体对于靶基因P53的激活和肿瘤的抑制程度各有差异[6]。另外,基因BCL2L1转录生成的lncRNA BCL-XL、BCL-XS和ENST具有相反的生物学调控功能[7]。由于RNA-seq存在reads不完全覆盖转录本、以及从头拼接转录本的复杂性和不可靠性,导致RNA-seq对于lncRNA的定量不准确。然而,Arraystar lncRNA新宝6下载是基于“一个转录本一个探针”的设计原理进行设计,可以准确检测不同异构体的表达。

    图释:MEG3转录的不同异构体对于p53的激活程度各有差异

    图释:Arraystar lncRNA新宝6下载通过设计独特探针来检测BCL的不同转录异构体

    要素3——提供lncRNA详细的注释和分析

    尽管lncRNA的研究越来越热,但是由于缺乏开放阅读框可以参考,所以和mRNA相比,大多数lncRNA仍然是注释信息匮乏,功能不明确。为了有效分析lncRNA的表达水平和相应的生物学功能,Arraystar lncRNA新宝6下载标准软件包集成了丰富的,详细的,系统的lncRNA注释和分析,以及该领域的最新研究进展,可以为用户提供一站式新宝6下载服务。最新升级的Arraystar lncRNA新宝6下载更是新增lncRNA的序列完整性、表观基因组信息、是否有DNA酶I超敏位点(DHS)、短肽编码潜能及亚细胞定位等详细注释,帮助研究者更快锁定研究目标。

    图释:Arraystar lncRNA新宝6下载结果对于lncRNA进行系统和详细的注释和分类


    参考文献

    [1]Cabili M.N. et al. (2015) "Localization and abundance analysis of human lncRNAs at single-cell and single-molecule resolution." Genome Biol. 16:20 [PMID: 25630241].

    [2]Wang K.C. et al. (2011) "A long noncoding RNA maintains active chromatin to coordinate homeotic gene expression." Nature 472(7341):120-4 [PMID: 21423168]

    [3]Engreitz J.M. et al. (2016) "Local regulation of gene expression by lncRNA promoters, transcription and splicing." Nature 539(7629):452-455 [PMID: 27783602]

    [4]Xu W. et al. (2011) "Human transcriptome array for high-throughput clinical studies." Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.  [PMID: 21317363]

    [5]Anders, S. et al .(2010). Differential expression analysis for sequence count data. Genome biology, 11(10), R106. [PMID: 20979621]

    [6]Hardwick S. A. et al . (2016). Spliced synthetic genes as internal controls in RNA sequencing experiments. Nature methods, 13(9), 792. [PMID: 27502218 ]

    [7]Zhang X. et al. (2010) "Maternally expressed gene 3 (MEG3) noncoding ribonucleic acid: isoform structure, expression, and functions." Endocrinology 151(3):939-47 [PMID: 20032057]

    [8]Boise L.H. et al. (1993) "bcl-x, a bcl-2-related gene that functions as a dominant regulator of apoptotic cell death." Cell 74(4):597-608 [PMID: 8358789]

    [9]Hon C.C. et al. (2017) "An atlas of human long non-coding RNAs with accurate 5' ends." Nature 543(7644):199-204 [PMID: 28241135]